Исследование стабильности коэнзима Q10 в БАД «Кудесан» в зависимости от условия хранения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ЭкоЦентр "Экосистема" разработал более 140 методических материалов по изучению природы:


Полевые определители для смартфонов и планшетов в магазинах RuStore, RuMarket, Google Play и App Store

Определители растений и животных для PC Windows

Определители
для PC

Сборники MP3 записей голосов птиц в природе

Голоса
птиц

Методики полевых экологических исследований

Методики
исследований

Учебные
видеофильмы

Определительные
таблицы

Карманные
определители

Всё это можно приобрести в нашем некоммерческом Интернет-магазине

ГЛАВНАЯ >>> ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЕ ПРОГРАММЫ >>> ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ И ПРОЕКТНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

Главная
English
Биологический кружок ВООП
Гостю кружка
Планы кружка
Экспедиции и выезды
Исследовательская работа
Программа "Parus"
История кружка
Контакты кружка
Полевой центр
Фотогалерея
Летопись биостанции
Статьи о биостанции
Исследовательские работы
Учебные программы
Полевые практикумы
Методические семинары
Вебинары
Исследовательская работа
Проектная деятельность
Экспедиции и лагеря
Экологические тропы
Экологические игры
Публикации (статьи)
Методические материалы
Наглядные определители
Карманные определители
Определительные таблицы
Энциклопедии природы России
Компьютерные определители
Мобильные определители
Учебные фильмы
Методические пособия
Полевой практикум
Природа России
Минералы и горные породы
Почвы
Грибы
Лишайники
Водоросли
Мохообразные
Травянистые растения
Деревья и кустарники
Ягоды и сочные плоды
Насекомые-вредители
Водные беспозвоночные
Дневные бабочки
Рыбы
Амфибии
Рептилии
Птицы, гнезда и голоса
Млекопитающие и следы
Фото растений и животных
Систематический каталог
Алфавитный каталог
Географический каталог
Поиск по названию
Галерея
Природные ландшафты мира
Физическая география России
Физическая география мира
Европа
Азия
Африка
Северная Америка
Южная Америка
Австралия и Новая Зеландия
Антарктика
Рефераты о природе
География
Геология и почвоведение
Микология
Ботаника
Культурные растения
Зоология беспозвоночных
Зоология позвоночных
Водная экология
Цитология, анатомия, медицина
Общая экология
Охрана природы
Заповедники России
Экологическое образование
Экологический словарь
Географический словарь
Художественная литература
Международные программы
Общая информация
Полевые центры (Великобритания)
Международные экспедиции (США)
Курс полевого образования (США)
Международные контакты
Интернет-магазин
Карманные определители
Цветные таблицы
Компьютерные определители
Энциклопедии природы
Методические пособия
Учебные фильмы
Комплекты материалов
Контакты
Гостевая книга
Ссылки
Партнеры
Наши баннеры
Карта сайта

Видео-360 по экологии на нашем Youtube канале

Если Вам понравился и пригодился наш сайт - кликните по иконке "своей" социальной сети:

Объявления:

Международные дни наблюдений за птицами!
Союз охраны птиц России приглашает российских любителей птиц принять участие в акции и загрузить результаты своих наблюдений на www.biodat.ru Подробнее >>>

Здесь может быть бесплатно размещено Ваше объявление о проводимом Всероссийском конкурсе, Слёте, Олимпиаде, любом другом важном мероприятии, связанном с экологическим образованием детей или охраной и изучением природы. Подробнее >>>

Мы публикуем на нашем сайте авторские образовательные программы, статьи по экологическому образованию детей в природе, детские исследовательские работы (проекты), основанные на полевом изучении природы. Подробнее >>>

[ sp ] : ml об : { lf }

Практикумы Семинары Вебинары Исследовательская работа Экспедиции и лагеря Экотропы Экологические игры Публикации

Обложка журнала "Исследовательская работа школьников" Титульная страница журнала "Исследовательская работа школьников" Приведенная ниже работа была опубликована в журнале "Исследовательская работа школьников" Издательского дома "Народное образование" и была любезно предоставлена главным редактором журнала О.В.Глушенковым в 2017 году.

Из огромного количества статей, опубликованных в журнале за годы его работы в 2011-2016 гг, мы отобрали публикации в области экологии, биологии, географии и краеведения, а также небольшое число работ по археологии, истории и культуре.

Для облегчения поиска и навигации по данному разделу, все работы сгруппированы по нескольким нижеследующим рубрикам: Общие вопросы - теория, Общие вопросы - практика, География, Биология, Экология - теория, Экология - практика, Детские исследовательские работы и проекты по географии, биологии и экологии

Пожалуйста, ставьте гиперссылку на сайт www.ecosystema.ru если Вы копируете материалы с этой страницы! Во избежание недоразумений ознакомьтесь с правилами использования и копирования материалов с сайта www.есоsystеmа.ru
Пригодилась эта страница? Поделитесь ею в своих социальных сетях:

Примечания: 1) приведенная ниже работа размещена на нашем сайте в оригинальном виде, т.е. так, как она была предоставлена для публикации в журнале; 2) автор сайта не несет ответственности за достоверность сведений, изложенных в работе; 3) данная работа является авторской и ее перепечатка возможна только с указанием авторов и активной гиперссылкой на наш сайт.

Исследование стабильности коэнзима Q10 в БАД «Кудесан»
в зависимости от условия хранения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Ольга Тихонова
МБОУ СОШ № 11, г. Обнинск, Калужская область

Руководитель: к.х.н. Пашкова Е.Б., ООО «БИОН»

1. Введение

Убихиноны (коферменты Q) были обнаружены в 1967 году, и уже через несколько лет получили широкое применение в качестве антиоксидантов. В последнее десятилетие была установлена связь между содержанием убихинона и нарушениями в деятельности сердечно-сосудистой системы. К настоящему моменту разработано большое количество биологически активных добавок, косметических и лекарственных препаратов, содержащих в своем составе кофермент Q₁₀, характерный для организма человека.

Убихиноны постоянно синтезируются в организме из тирозина либо фенилаланина [1]. Больше всего их в органах с активным метаболизмом – сердце, печени, селезенке и мозге. Суммарный уровень коэнзима Q₁₀ достигает своего максимума к 20 годам и затем постепенно снижается с возрастом [1]. Поэтому необходимо поступление коэнзима Q₁₀в организм человека с пищей либо при помощи биологически активных добавок (БАДов). Содержание коэнзима Q₁₀ в продуктах питания относительно невелико. Например, в шпинате (продукт, наиболее богатый коэнзимом) его содержание составляет всего лишь 200　мкг/г. В мясных и рыбных продуктах (говядина, свинина, морская рыба) количество Q₁₀ находится на уровне 10-20 мкг/г [приложение 1]. Поэтому наиболее удобным источником коэнзима являются разнообразные биологические добавки.

Одной из таких БАД, содержащих коэнзим Q₁₀является «Кудесан». В нем содержится 30 мг/мл коэнзима Q₁₀ (как заявлено производителем). Но при этом в сопроводительной документации не указаны условия хранения БАД «Кудесан». Достоверно не известно, меняется ли концентрация коэнзима в образце с течением времени приема препарата (35–40　дней). Соответственно, целью моей работы являлось исследование стабильности коэнзима Q₁₀ в БАД на протяжении этого времени, а также выбор оптимальных условий хранения вскрытой упаковки.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

Изучить существующие методы определения коэнзима Q₁₀ в различных объектах;
Разработать методику определения Q₁₀ в БАД «Кудесан»;
Исследовать стабильность коэнзима при различных условиях хранения.

Литературный обзор

Убихиноны представляют собой 2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохиноны с полипренильной цепочкой различной длины в шестом положении (рис. 1). На основании рекомендации IUPAC убихиноны обозначают как Q_n, где n – число изопреновых звеньев в боковой цепи. Все изопреновые звенья в молекуле находятся в транс-положении. Такая структура придает убихинону высокое сродство к клеточным мембранам [2].

Рис. 1. Структурная формула убихинона.

Одной из функций коэнзимов Q в организме является перенос электронов при синтезе АТФ на мембранах митохондрий [3]. Не менее важной является его роль как жирорастворимого антиоксиданта. Восстановленная форма – убихинол – обладает способностью захватывать пероксидные радикалы (LOO∙), защищая таким образом клетки.

Q_nH₂ + 2LOO· = Q_n + 2LOOH

Рис. 2. Структурная формула убихинола.

Соотношение окисленной и восстановленной формы постоянно вне зависимости от того, в какой форме коэнзим поступает в организм человека. Нарушение этого соотношения может свидетельствовать о заболеваниях обмена веществ, а также проблемах с сердечно-сосудистой системой [1].

Все убихиноны нерастворимы в воде, зато растворяются в большинстве органических растворителей. Соответственно, БАД, в состав которых входят коэнзимы, должны в своей основе содержать значительное количество либо спирта, либо растительных масел. «Кудесан» является достаточно сложной многокомпонентной системой. В его состав, помимо коэнзима, входят добавки жирорастворимых витаминов, растительные масла, эмульгаторы и консерванты. Таким образом, выбранный для анализа метод определения Q₁₀ должен быть достаточно селективным.

Исходя из литературных данных, для определения коэнзимов Q применяют три основные группы методов: электрохимические, спектрофотометрические и хроматографические [2]. Однако электрохимический метод требует сложной пробоподготовки, а спектрофотометрический метод хоть и является дешевым и быстрым, но не обладает достаточной селективностью. Поэтому выбрали метод высокоэффективной жидкостной (жидкостнотвердофазной) хроматографии.

Хроматография – физико-химический метод разделения веществ в динамических условиях. Компоненты разделяемой смеси распределяются между двумя фазами, неподвижной и подвижной (элюент). Неподвижная фаза представляет собой сорбент с развитой поверхностью, а подвижная – поток газа (пара, флюида – вещества в сверхкритическом состоянии) или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента [4].

Рис. 3. Схема жидкостного хроматографа

Подвижная фаза (элюент) прокачивается насосом через хроматографическую колонку, где, собственно, и происходит разделение компонентов пробы. Далее вещества вместе с током подвижной фазы попадают в детектор, который дает отклик (аналитический сигнал) на их присутствие в элюате. Подвижная фаза может состоять из одного или нескольких растворителей, причем их концентрация в ходе анализа может оставаться, как постоянной (изократический вариант), так и меняться по заданной программе (градиентный режим). Ввод пробы осуществляется либо вручную, либо при помощи специального устройства для автоматического ввода – автосэмплера. Управление всеми модулями прибора, сбор и обработка данных осуществляются с помощью компьютера и набора соответствующих программ. Все детекторы можно разделить на селективные (которые чувствительны только к определенным классам химических соединений) и универсальные (дающие отклик на широкий круг веществ). В литературе описано большое количество различных вариантов детектирования, применяемых при хроматографическом определении коэнзима Q₁₀.

В последнее время широкое распространение получило масс-спектрометрическое детектирование. Его принцип основан на том, что все соединения, содержащиеся в элюате, ионизируются, и прибор регистрирует ион с определенным значением масса/заряд (m/z). Это значение является уникальным для каждого соединения, что обуславливает очень высокую селективность и чувствительность определения. Метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием активно используется при клинических исследованиях, при работе со сложными биологическими образцами (плазма крови, ткани органов) [4]. Из минусов такого оборудования в первую очередь нужно отметить высокую цену и трудности в эксплуатации.

Наличие хинольной группировки в составе коэнзимов Q₁₀ делает возможным использование электрохимического детектирования. В этом случае регистрируется переход от восстановленной формы коэнзима к окисленной. Но такой вариант детектирования требует достаточно сложного оборудования, например, детектор с двойной ячейкой [5].

Наиболее простой, доступный и распространенный вариант – спектрофотометрическое детектирование. Единственный недостаток этого метода заключается в низкой селективности детектирования, поэтому необходимо предварительное полное разделение всех компонентов анализируемой смеси.

Таким образом, для нашей работы мы выбрали самый доступный и распространенный спектрофотометрический детектор.

3. Экспериментальная часть

Анализ проводили на жидкостном хроматографе Acella 600 (Thermo, США). Хроматограф состоял из градиентного насоса, он-лайн дегазатора подвижной фазы, автосэмплера, термостата колонок и диодно-матричного детектора. Разделение проводили на колонке Luna C18(2) размером 2,0 × 100 мм, размер зерна сорбента 1,9 мкм (Phenomenex, Германия). Управление хроматографом и обработку данных проводили с помощью программного комплекса Xcalibur.

Для приготовления подвижной фазы использовали растворители класса «gradient grade» производства компании Panreac (Испания).

Взвешивание стандартных образцов проводили на весах Mettler Toledo H700, точность которых составляла 0,00001 г.

Разбавление растворов проводили с помощью автоматических дозаторов Eppendorf с рабочим диапазоном 100-1000 и 20-200 мкл. Допустимая погрешность измерения составляла не более 5%.

Результаты и их обсуждение

Подбор и оптимизация условий хроматографического разделения.

Поскольку коэнзим имеет полярную структуру, для разделения смеси выбрали вариант обращено-фазовой хроматографии. В данном режиме неподвижная фаза является менее полярной в сравнении с подвижной.

Вследствие гидрофобности коэнзима Q₁₀ следует ожидать, что он будет удерживаться на неполярной колонке в течение длительного времени, поэтому в качестве элюента необходим растворитель или смесь растворителей с высокой элюирующей способностью. В литературе описываются подвижные фазы на основе изопропилового спирта [6], но вязкость таких растворов и, соответственно давление, которое нужно приложить, чтобы прокачать элюент через колонку, велико [7]. Поэтому к изопропанолу добавляли растворитель, обладающей меньшей вязкостью и хорошо смешивающийся с ним – ацетонитрил.

На первом этапе работы выбрали оптимальное соотношение компонентов в подвижной фазе. Изопропиловый спирт и ацетонитрил смешивали в определенных пропорциях, уравновешивали систему в течение 10 минут и вводили в прибор образец БАД «Кудесан», разбавленный в 10 раз подвижной фазой. Детектирование осуществляли спектрофотометрически при длине волны 275 нм (подбор условий детектирования см. далее). Зависимость времени удерживания коэнзима Q₁₀ от концентрации изопропилового cпирта в подвижной фазе показана на рис. 4.

Рис. 4 Зависимость времени удерживания коэнзима Q10 от содержания изопропилового спирта в подвижной фазе.

На рис. 4 видно, что при содержании изопропилового спирта в смеси 90 % и больше, пик коэнзима выходит вместе с мертвым временем (время выхода неудерживаемых компонентов). При концентрации изопропанола в диапазоне от 70 до 90% пик коэнзима перекрывается с пиками примесей - других составляющих «Кудесан» [приложение 2]. При 60 % изопропилового спирта все пики хорошо разрешены, вместе с тем, анализ занимает очень мало времени (не более 5 минут). При концентрации изопропанола до 60 %,пики хорошо разрешены, но анализ занимает неоправданно много времени. Поэтому для всех дальнейших экспериментов использовали подвижную фазу состава изопропиловый спирт : ацетонитрил – 60:40. Скорость потока подвижной фазы составила 400 мкл/мин. Хроматограмма модельного раствора коэнзима Q₁₀ представлена на рис.5.

Рис.5. Хроматограмма модельного раствора Q10. Концентрация коэнзима 0.5 мг/мл.

С помощью диодно-матричного детектора были изучены спектры поглощения стандартного раствора коэнзима Q10.

Рис.6 Спектр поглощения раствора Q10. Концентрация коэнзима 0,5 мг/мл.

При подборе колонки учитывали строение определяемого соединения, чтобы соединение на ней задерживалось, т.е. сорбировалось. Если оно не будет задерживаться, взаимодействовать с неподвижной фазой внутри колонки, то вводимая смесь веществ, не разделиться и на хроматограмме не будет разделения пиков. Молекула коэнзима гидрофобная, поэтому подобрали колонку, заполненную гидрофобным сорбентом. Самый распространенный, изученный и доступный вариант – силикагель с привитым к нему гидрофобным углеводородным радикалом С₁₈(рис. 7).

Рис.7. Структурная формула модифицированного силикагеля

Перед анализом образец «Кудесана» разводили в 100 раз подвижной фазой для того, чтобы концентрация коэнзима в пробе была не такой большой. Детектор при концентрации 30 мг/л просто зашкалит, и мы не сможем правильно посчитать концентрацию, отклик не будет пропорционален количеству определяемого вещества. Кроме этого неразбавленный «Кудесан» имеет большую вязкость, что мешает осуществить воспроизводимый ввод пробы.

Детектирование проводили с использованием спектрофотометрического детектора (он измеряет поглощение жидкости, которая через него проходит) на длине волны 275 нм.

Рис. 8. Хроматограмма препарата «Кудесан» (условия см. в тексте).

Видно, что в предложенных нами условиях другие компоненты «Кудесан» не мешают определению Q10.

Для построения градуировочной зависимости точную навеску модельного образца массой около 25 мг помещали в мерную колбу, добавляли 15 мл изопропилового спирта и тщательно перемешивали. Объем доводили до метки ацетонитрилом. Полученный раствор с концентрацией 1 мг/мл последовательно разбавляли, чтобы получить серию растворов с содержанием коэнзима 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 и 0,5 мг/мл соответственно. Каждый градуировочный раствор анализировали два раза. Полученная зависимость приведена на рис. 9.

Рис.9. Зависимость площади хроматографического пика коэнзима от его концентрации

Затем проводили регулярные измерения в течение 40 дней. Время приема препарата рассчитывали из рекомендуемой суточной дозы (0,5 мл в день). Были смоделированы следующие ситуации: открытая упаковка «Кудесан» хранится в холодильнике (4°С), другая открытая упаковка хранится при комнатной температуре (25 °С), третья упаковка хранится около батареи (40°С). Регулярно проводили анализ содержимого каждой упаковки. Для точности результата из каждой смеси готовили по три пробы, а для построения зависимости считали среднее значение. Результаты измерений отражены на рисунке 10.

Рис. 10. Изменение концентрации коэнзима Q10 в БАД «Кудесан» в течение 40 дней

На рис. 9 видно, что в «Кудесане», хранящемся при температуре 4 °С и 25 °С, содержание коэнзима Q₁₀практически не меняется (отклонения находятся в пределах погрешности), тогда как при температуре 40 °С содержание коэнзима Q₁₀уменьшилось на 15 %. Значит, при температуре выше комнатной хранить БАД «Кудесан» не следует.

5. Заключение

Подобраны и оптимизированы условия хроматографического определения коэнзима Q₁₀ в БАД «Кудесан»: разделение смеси на колонке Luna С18 с использованием подвижной фазы изопропанол C₃H₇OH: ацетонитрил CH₃CN в соотношении 60:40.
Построена градуировочная зависимость для Q₁₀: площадь хроматографического пика прямо пропорциональна концентрации коэнзима Q₁₀в диапазоне 0,01 – 1 мг/мл.
Изучена стабильность коэнзима Q₁₀ в БАД «Кудесан» при различных условиях хранения: при температуре 4 °С и 20 °С концентрация коэнзима Q₁₀в течение 40 дней практически не изменилась, а при температуре 40 °С концентрация коэнзима уменьшилась на 15%.

Список использованной литературы

[1] Пашкова Е.Б., Пирогов А.В., Бендрышев А.А., Шпигун О.А. Определение коэнзима Q10 и родственных соединений в биологических объектах методом ВЭЖХ-МС // Тез. докладов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». Москва, 2007

[2] Коферменты. Под ред. проф. В.А. Яковлева. М.: Медицина, 1973. 377 с.

[3] Химическая энциклопедия. Гл. ред. Н.С.Зефиров. М.: Советская энциклопедия, 1999. Т. 5. Стр. 21-22.

[4] Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография. М. 1986. 284 с.

[5] Медведев О.С., Городецкая Е.А, Каленикова Е.И.. Фармакокинетика коэнзима Q10. Бюллетень эксперимаентальной биологии и медицины. 2008. № 9, стр. 281-287.

[6] Патент RU 2377019. 01.02.2006 г. Транспортирующий наполнитель для энтерального применения.

[7] Химический энциклопедический словарь. Гл. ред. И.Л. Кнунянц.- М.: Советская энциклопедия, 1983. 792 с.

7. Приложение

Приложение 1

Содержание коэнзима Q₁₀ в биологических объектах

Объект	Концентрация, мкг/г
Шпинат	203
Крыса (почки)	22,0
Крыса (печень)	21,3
Крыса (мозг)	18,9
Курица (мозг)	17,1
Крыса (сердце)	16,9
Говяжий фарш	16
Балтийская сельдь	13
Крыса (селезенка)	9,2
Крыса (камбаловидная мышца)	6
Мышь (мозг)	5,2
Мышь (сердце)	5
Мышечная ткань лягушки	4,9
Крыса (легкие)	2,4
Апельсины	2
Человек (плазма крови)	0,8

Приложение 2

Хроматограмма препарата «Кудесан». Разбавление в 100 раз подвижной фазой. Подвижная　фаза – 80% изопропанола, 20% ацетонитрила.

Рубрики (разделы) сайта, содержащие публикации по проблемам организации исследовательской и проектной деятельности школьников:

Общие вопросы - теория	География	Экология - теория
Общие вопросы - практика	Биология	Экология - практика
Детские исследовательские работы и проекты по географии, биологии и экологии

На нашем сайте, помимо текущего раздела, есть также три других раздела, также посвященные исследовательской и проектной деятельности школьников. Это раздел Вебинары, посвященный вопросам организации исследовательской деятельности школьников в природе, а также разделы Исследовательские работы и Публикации. Последние два раздела отличаются от текущего раздела тем, что там собраны детские исследовательские работы и публикации педагогов по тематике "полевого изучение природы", т.е. исключительно работы, выполненные или описывающие исследовательскую деятельность школьников В ПРИРОДЕ. Данный же раздел посвящен более общим вопросам организации исследовательской и проектной деятельности.

Внимание! На нашем сайте мы готовы публиковать статьи по вопросам организации экологического образования детей в природе, которые могут быть полезны коллегам по всей стране. Это могут быть проблемные статьи, авторские образовательные программы, методические пособия, нормативно-инструктивные документы и материалы, фотографии, отчеты и т.п. по таким тематикам как:

полевые практикумы,
экологические образовательные экспедиции,
экологические лагеря,
конкурсы детских исследовательских работ (проектов),
материалы семинаров и конференций,
методики полевых исследований (проектной деятельности),
детские исследовательские работы (проекты),
экологические тропы,
"экспедиционная жизнь".

О Вас и Вашем опыте узнает вся Россия, а главное - Вы сможете принести пользу системе экологического образования нашей страны, "вложить свою лепту" в совершенствование форм и методов работы с детьми!

Если Вы готовы поделиться своим опытом с коллегами по всей стране - присылайте свои предложения (кратко опишите свои материалы), мы рассмотрим их и вместе обсудим наиболее оптимальную форму их публикации на нашем сайте.

Панорамный фильм по экологии (VR-360) на нашем Youtube канале

Поделиться/Share:

: ml :

Порекомендуйте нас в "своих" социальных сетях:

- share this page with your friends!

Панорамный фильм по экологии (VR-360) на нашем Youtube канале