|
Ïðàêòèêóìû
Ñåìèíàðû
Âåáèíàðû
Èññëåäîâàòåëüñêàÿ ðàáîòà
Ýêñïåäèöèè è ëàãåðÿ
Ýêîòðîïû
Ýêîëîãè÷åñêèå èãðû
Ïóáëèêàöèè
 
Ïðèâåäåííàÿ íèæå ðàáîòà áûëà
îïóáëèêîâàíà â æóðíàëå "Èññëåäîâàòåëüñêàÿ
ðàáîòà øêîëüíèêîâ" Èçäàòåëüñêîãî äîìà
"Íàðîäíîå îáðàçîâàíèå" è áûëà ëþáåçíî
ïðåäîñòàâëåíà ãëàâíûì ðåäàêòîðîì æóðíàëà Î.Â.Ãëóøåíêîâûì
â 2017 ãîäó.
Èç îãðîìíîãî êîëè÷åñòâà ñòàòåé, îïóáëèêîâàííûõ
â æóðíàëå çà ãîäû åãî ðàáîòû â 2011-2016 ãã, ìû
îòîáðàëè ïóáëèêàöèè â îáëàñòè ýêîëîãèè, áèîëîãèè,
ãåîãðàôèè è êðàåâåäåíèÿ, à òàêæå íåáîëüøîå ÷èñëî
ðàáîò ïî àðõåîëîãèè, èñòîðèè è êóëüòóðå.
Äëÿ îáëåã÷åíèÿ ïîèñêà è íàâèãàöèè ïî
äàííîìó ðàçäåëó, âñå ðàáîòû ñãðóïïèðîâàíû ïî
íåñêîëüêèì íèæåñëåäóþùèì ðóáðèêàì:
Îáùèå âîïðîñû - òåîðèÿ,
Îáùèå âîïðîñû - ïðàêòèêà,
Ãåîãðàôèÿ,
Áèîëîãèÿ,
Ýêîëîãèÿ - òåîðèÿ,
Ýêîëîãèÿ - ïðàêòèêà,
Äåòñêèå èññëåäîâàòåëüñêèå ðàáîòû è ïðîåêòû ïî ãåîãðàôèè, áèîëîãèè è ýêîëîãèè
Ïðèìå÷àíèÿ: 1) ïðèâåäåííàÿ íèæå ðàáîòà ðàçìåùåíà íà íàøåì ñàéòå â îðèãèíàëüíîì âèäå, ò.å. òàê, êàê îíà áûëà ïðåäîñòàâëåíà äëÿ ïóáëèêàöèè â æóðíàëå; 2) àâòîð ñàéòà íå íåñåò îòâåòñòâåííîñòè çà äîñòîâåðíîñòü ñâåäåíèé, èçëîæåííûõ â ðàáîòå; 3) äàííàÿ ðàáîòà ÿâëÿåòñÿ àâòîðñêîé è åå ïåðåïå÷àòêà âîçìîæíà òîëüêî ñ óêàçàíèåì àâòîðîâ è àêòèâíîé ãèïåðññûëêîé íà íàø ñàéò.
Èññëåäîâàíèå ñòàáèëüíîñòè êîýíçèìà Q10 â ÁÀÄ «Êóäåñàí»
â çàâèñèìîñòè îò óñëîâèÿ õðàíåíèÿ ìåòîäîì âûñîêîýôôåêòèâíîé æèäêîñòíîé õðîìàòîãðàôèè
Îëüãà Òèõîíîâà
ÌÁÎÓ ÑÎØ ¹ 11, ã. Îáíèíñê, Êàëóæñêàÿ îáëàñòü
Ðóêîâîäèòåëü: ê.õ.í. Ïàøêîâà Å.Á.,
ÎÎÎ «ÁÈÎÍ»
1. Ââåäåíèå
Óáèõèíîíû (êîôåðìåíòû Q) áûëè îáíàðóæåíû â 1967 ãîäó, è óæå ÷åðåç íåñêîëüêî ëåò ïîëó÷èëè øèðîêîå ïðèìåíåíèå â êà÷åñòâå àíòèîêñèäàíòîâ.  ïîñëåäíåå äåñÿòèëåòèå áûëà óñòàíîâëåíà ñâÿçü ìåæäó ñîäåðæàíèåì óáèõèíîíà è íàðóøåíèÿìè â äåÿòåëüíîñòè ñåðäå÷íî-ñîñóäèñòîé ñèñòåìû. Ê íàñòîÿùåìó ìîìåíòó ðàçðàáîòàíî áîëüøîå êîëè÷åñòâî áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ äîáàâîê, êîñìåòè÷åñêèõ è ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ, ñîäåðæàùèõ â ñâîåì ñîñòàâå êîôåðìåíò Q10, õàðàêòåðíûé äëÿ îðãàíèçìà ÷åëîâåêà.
Óáèõèíîíû ïîñòîÿííî ñèíòåçèðóþòñÿ â îðãàíèçìå èç òèðîçèíà ëèáî ôåíèëàëàíèíà [1]. Áîëüøå âñåãî èõ â îðãàíàõ ñ àêòèâíûì ìåòàáîëèçìîì – ñåðäöå, ïå÷åíè, ñåëåçåíêå è ìîçãå. Ñóììàðíûé óðîâåíü êîýíçèìà Q10 äîñòèãàåò ñâîåãî ìàêñèìóìà ê 20 ãîäàì è çàòåì ïîñòåïåííî ñíèæàåòñÿ ñ âîçðàñòîì [1]. Ïîýòîìó íåîáõîäèìî ïîñòóïëåíèå êîýíçèìà Q10 â îðãàíèçì ÷åëîâåêà ñ ïèùåé ëèáî ïðè ïîìîùè áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ äîáàâîê (ÁÀÄîâ). Ñîäåðæàíèå êîýíçèìà Q10 â ïðîäóêòàõ ïèòàíèÿ îòíîñèòåëüíî íåâåëèêî. Íàïðèìåð, â øïèíàòå (ïðîäóêò, íàèáîëåå áîãàòûé êîýíçèìîì) åãî ñîäåðæàíèå ñîñòàâëÿåò âñåãî ëèøü 200 ìêã/ã.  ìÿñíûõ è ðûáíûõ ïðîäóêòàõ (ãîâÿäèíà, ñâèíèíà, ìîðñêàÿ ðûáà) êîëè÷åñòâî Q10 íàõîäèòñÿ íà óðîâíå 10-20 ìêã/ã [ïðèëîæåíèå 1]. Ïîýòîìó íàèáîëåå óäîáíûì èñòî÷íèêîì êîýíçèìà ÿâëÿþòñÿ ðàçíîîáðàçíûå áèîëîãè÷åñêèå äîáàâêè.
Îäíîé èç òàêèõ ÁÀÄ, ñîäåðæàùèõ êîýíçèì Q10 ÿâëÿåòñÿ «Êóäåñàí».  íåì ñîäåðæèòñÿ 30 ìã/ìë êîýíçèìà Q10 (êàê çàÿâëåíî ïðîèçâîäèòåëåì). Íî ïðè ýòîì â ñîïðîâîäèòåëüíîé äîêóìåíòàöèè íå óêàçàíû óñëîâèÿ õðàíåíèÿ ÁÀÄ «Êóäåñàí». Äîñòîâåðíî íå èçâåñòíî, ìåíÿåòñÿ ëè êîíöåíòðàöèÿ êîýíçèìà â îáðàçöå ñ òå÷åíèåì âðåìåíè ïðèåìà ïðåïàðàòà (35–40 äíåé). Ñîîòâåòñòâåííî, öåëüþ ìîåé ðàáîòû ÿâëÿëîñü èññëåäîâàíèå ñòàáèëüíîñòè êîýíçèìà Q10 â ÁÀÄ íà ïðîòÿæåíèè ýòîãî âðåìåíè, à òàêæå âûáîð îïòèìàëüíûõ óñëîâèé õðàíåíèÿ âñêðûòîé óïàêîâêè.
Äëÿ ýòîãî íåîáõîäèìî áûëî ðåøèòü ñëåäóþùèå çàäà÷è:
- Èçó÷èòü ñóùåñòâóþùèå ìåòîäû îïðåäåëåíèÿ êîýíçèìà Q10 â ðàçëè÷íûõ îáúåêòàõ;
- Ðàçðàáîòàòü ìåòîäèêó îïðåäåëåíèÿ Q10 â ÁÀÄ «Êóäåñàí»;
- Èññëåäîâàòü ñòàáèëüíîñòü êîýíçèìà ïðè ðàçëè÷íûõ óñëîâèÿõ õðàíåíèÿ.
- Ëèòåðàòóðíûé îáçîð
Óáèõèíîíû ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé 2,3-äèìåòîêñè-5-ìåòèë-1,4-áåíçîõèíîíû ñ ïîëèïðåíèëüíîé öåïî÷êîé ðàçëè÷íîé äëèíû â øåñòîì ïîëîæåíèè (ðèñ. 1). Íà îñíîâàíèè ðåêîìåíäàöèè IUPAC óáèõèíîíû îáîçíà÷àþò êàê Qn, ãäå n – ÷èñëî èçîïðåíîâûõ çâåíüåâ â áîêîâîé öåïè. Âñå èçîïðåíîâûå çâåíüÿ â ìîëåêóëå íàõîäÿòñÿ â òðàíñ-ïîëîæåíèè. Òàêàÿ ñòðóêòóðà ïðèäàåò óáèõèíîíó âûñîêîå ñðîäñòâî ê êëåòî÷íûì ìåìáðàíàì [2].
Ðèñ. 1. Ñòðóêòóðíàÿ ôîðìóëà óáèõèíîíà.
Îäíîé èç ôóíêöèé êîýíçèìîâ Q â îðãàíèçìå ÿâëÿåòñÿ ïåðåíîñ ýëåêòðîíîâ ïðè ñèíòåçå ÀÒÔ íà ìåìáðàíàõ ìèòîõîíäðèé [3]. Íå ìåíåå âàæíîé ÿâëÿåòñÿ åãî ðîëü êàê æèðîðàñòâîðèìîãî àíòèîêñèäàíòà. Âîññòàíîâëåííàÿ ôîðìà – óáèõèíîë – îáëàäàåò ñïîñîáíîñòüþ çàõâàòûâàòü ïåðîêñèäíûå ðàäèêàëû (LOO∙), çàùèùàÿ òàêèì îáðàçîì êëåòêè.
QnH 2 + 2LOO· = Qn + 2LOOH
Ðèñ. 2. Ñòðóêòóðíàÿ ôîðìóëà óáèõèíîëà.
Ñîîòíîøåíèå îêèñëåííîé è âîññòàíîâëåííîé ôîðìû ïîñòîÿííî âíå çàâèñèìîñòè îò òîãî, â êàêîé ôîðìå êîýíçèì ïîñòóïàåò â îðãàíèçì ÷åëîâåêà. Íàðóøåíèå ýòîãî ñîîòíîøåíèÿ ìîæåò ñâèäåòåëüñòâîâàòü î çàáîëåâàíèÿõ îáìåíà âåùåñòâ, à òàêæå ïðîáëåìàõ ñ ñåðäå÷íî-ñîñóäèñòîé ñèñòåìîé [1].
Âñå óáèõèíîíû íåðàñòâîðèìû â âîäå, çàòî ðàñòâîðÿþòñÿ â áîëüøèíñòâå îðãàíè÷åñêèõ ðàñòâîðèòåëåé. Ñîîòâåòñòâåííî, ÁÀÄ, â ñîñòàâ êîòîðûõ âõîäÿò êîýíçèìû, äîëæíû â ñâîåé îñíîâå ñîäåðæàòü çíà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî ëèáî ñïèðòà, ëèáî ðàñòèòåëüíûõ ìàñåë. «Êóäåñàí» ÿâëÿåòñÿ äîñòàòî÷íî ñëîæíîé ìíîãîêîìïîíåíòíîé ñèñòåìîé.  åãî ñîñòàâ, ïîìèìî êîýíçèìà, âõîäÿò äîáàâêè æèðîðàñòâîðèìûõ âèòàìèíîâ, ðàñòèòåëüíûå ìàñëà, ýìóëüãàòîðû è êîíñåðâàíòû. Òàêèì îáðàçîì, âûáðàííûé äëÿ àíàëèçà ìåòîä îïðåäåëåíèÿ Q10 äîëæåí áûòü äîñòàòî÷íî ñåëåêòèâíûì.
Èñõîäÿ èç ëèòåðàòóðíûõ äàííûõ, äëÿ îïðåäåëåíèÿ êîýíçèìîâ Q ïðèìåíÿþò òðè îñíîâíûå ãðóïïû ìåòîäîâ: ýëåêòðîõèìè÷åñêèå, ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèå è õðîìàòîãðàôè÷åñêèå [2]. Îäíàêî ýëåêòðîõèìè÷åñêèé ìåòîä òðåáóåò ñëîæíîé ïðîáîïîäãîòîâêè, à ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé ìåòîä õîòü è ÿâëÿåòñÿ äåøåâûì è áûñòðûì, íî íå îáëàäàåò äîñòàòî÷íîé ñåëåêòèâíîñòüþ. Ïîýòîìó âûáðàëè ìåòîä âûñîêîýôôåêòèâíîé æèäêîñòíîé (æèäêîñòíîòâåðäîôàçíîé) õðîìàòîãðàôèè.
Õðîìàòîãðàôèÿ – ôèçèêî-õèìè÷åñêèé ìåòîä ðàçäåëåíèÿ âåùåñòâ â äèíàìè÷åñêèõ óñëîâèÿõ. Êîìïîíåíòû ðàçäåëÿåìîé ñìåñè ðàñïðåäåëÿþòñÿ ìåæäó äâóìÿ ôàçàìè, íåïîäâèæíîé è ïîäâèæíîé (ýëþåíò). Íåïîäâèæíàÿ ôàçà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ñîðáåíò ñ ðàçâèòîé ïîâåðõíîñòüþ, à ïîäâèæíàÿ – ïîòîê ãàçà (ïàðà, ôëþèäà – âåùåñòâà â ñâåðõêðèòè÷åñêîì ñîñòîÿíèè) èëè æèäêîñòè. Ïîòîê ïîäâèæíîé ôàçû ôèëüòðóåòñÿ ÷åðåç ñëîé ñîðáåíòà èëè ïåðåìåùàåòñÿ âäîëü ñëîÿ ñîðáåíòà [4].
Ðèñ. 3. Ñõåìà æèäêîñòíîãî õðîìàòîãðàôà
Ïîäâèæíàÿ ôàçà (ýëþåíò) ïðîêà÷èâàåòñÿ íàñîñîì ÷åðåç õðîìàòîãðàôè÷åñêóþ êîëîíêó, ãäå, ñîáñòâåííî, è ïðîèñõîäèò ðàçäåëåíèå êîìïîíåíòîâ ïðîáû. Äàëåå âåùåñòâà âìåñòå ñ òîêîì ïîäâèæíîé ôàçû ïîïàäàþò â äåòåêòîð, êîòîðûé äàåò îòêëèê (àíàëèòè÷åñêèé ñèãíàë) íà èõ ïðèñóòñòâèå â ýëþàòå. Ïîäâèæíàÿ ôàçà ìîæåò ñîñòîÿòü èç îäíîãî èëè íåñêîëüêèõ ðàñòâîðèòåëåé, ïðè÷åì èõ êîíöåíòðàöèÿ â õîäå àíàëèçà ìîæåò îñòàâàòüñÿ, êàê ïîñòîÿííîé (èçîêðàòè÷åñêèé âàðèàíò), òàê è ìåíÿòüñÿ ïî çàäàííîé ïðîãðàììå (ãðàäèåíòíûé ðåæèì). Ââîä ïðîáû îñóùåñòâëÿåòñÿ ëèáî âðó÷íóþ, ëèáî ïðè ïîìîùè ñïåöèàëüíîãî óñòðîéñòâà äëÿ àâòîìàòè÷åñêîãî ââîäà – àâòîñýìïëåðà. Óïðàâëåíèå âñåìè ìîäóëÿìè ïðèáîðà, ñáîð è îáðàáîòêà äàííûõ îñóùåñòâëÿþòñÿ ñ ïîìîùüþ êîìïüþòåðà è íàáîðà ñîîòâåòñòâóþùèõ ïðîãðàìì. Âñå äåòåêòîðû ìîæíî ðàçäåëèòü íà ñåëåêòèâíûå (êîòîðûå ÷óâñòâèòåëüíû òîëüêî ê îïðåäåëåííûì êëàññàì õèìè÷åñêèõ ñîåäèíåíèé) è óíèâåðñàëüíûå (äàþùèå îòêëèê íà øèðîêèé êðóã âåùåñòâ).  ëèòåðàòóðå îïèñàíî áîëüøîå êîëè÷åñòâî ðàçëè÷íûõ âàðèàíòîâ äåòåêòèðîâàíèÿ, ïðèìåíÿåìûõ ïðè õðîìàòîãðàôè÷åñêîì îïðåäåëåíèè êîýíçèìà Q10.
 ïîñëåäíåå âðåìÿ øèðîêîå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èëî ìàññ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêîå äåòåêòèðîâàíèå. Åãî ïðèíöèï îñíîâàí íà òîì, ÷òî âñå ñîåäèíåíèÿ, ñîäåðæàùèåñÿ â ýëþàòå, èîíèçèðóþòñÿ, è ïðèáîð ðåãèñòðèðóåò èîí ñ îïðåäåëåííûì çíà÷åíèåì ìàññà/çàðÿä (m/z). Ýòî çíà÷åíèå ÿâëÿåòñÿ óíèêàëüíûì äëÿ êàæäîãî ñîåäèíåíèÿ, ÷òî îáóñëàâëèâàåò î÷åíü âûñîêóþ ñåëåêòèâíîñòü è ÷óâñòâèòåëüíîñòü îïðåäåëåíèÿ. Ìåòîä ÂÝÆÕ ñ ìàññ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêèì äåòåêòèðîâàíèåì àêòèâíî èñïîëüçóåòñÿ ïðè êëèíè÷åñêèõ èññëåäîâàíèÿõ, ïðè ðàáîòå ñî ñëîæíûìè áèîëîãè÷åñêèìè îáðàçöàìè (ïëàçìà êðîâè, òêàíè îðãàíîâ) [4]. Èç ìèíóñîâ òàêîãî îáîðóäîâàíèÿ â ïåðâóþ î÷åðåäü íóæíî îòìåòèòü âûñîêóþ öåíó è òðóäíîñòè â ýêñïëóàòàöèè.
Íàëè÷èå õèíîëüíîé ãðóïïèðîâêè â ñîñòàâå êîýíçèìîâ Q10 äåëàåò âîçìîæíûì èñïîëüçîâàíèå ýëåêòðîõèìè÷åñêîãî äåòåêòèðîâàíèÿ.  ýòîì ñëó÷àå ðåãèñòðèðóåòñÿ ïåðåõîä îò âîññòàíîâëåííîé ôîðìû êîýíçèìà ê îêèñëåííîé. Íî òàêîé âàðèàíò äåòåêòèðîâàíèÿ òðåáóåò äîñòàòî÷íî ñëîæíîãî îáîðóäîâàíèÿ, íàïðèìåð, äåòåêòîð ñ äâîéíîé ÿ÷åéêîé [5].
Íàèáîëåå ïðîñòîé, äîñòóïíûé è ðàñïðîñòðàíåííûé âàðèàíò – ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîå äåòåêòèðîâàíèå. Åäèíñòâåííûé íåäîñòàòîê ýòîãî ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â íèçêîé ñåëåêòèâíîñòè äåòåêòèðîâàíèÿ, ïîýòîìó íåîáõîäèìî ïðåäâàðèòåëüíîå ïîëíîå ðàçäåëåíèå âñåõ êîìïîíåíòîâ àíàëèçèðóåìîé ñìåñè.
Òàêèì îáðàçîì, äëÿ íàøåé ðàáîòû ìû âûáðàëè ñàìûé äîñòóïíûé è ðàñïðîñòðàíåííûé ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêèé äåòåêòîð.
3. Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü
Àíàëèç ïðîâîäèëè íà æèäêîñòíîì õðîìàòîãðàôå Acella 600 (Thermo, ÑØÀ). Õðîìàòîãðàô ñîñòîÿë èç ãðàäèåíòíîãî íàñîñà, îí-ëàéí äåãàçàòîðà ïîäâèæíîé ôàçû, àâòîñýìïëåðà, òåðìîñòàòà êîëîíîê è äèîäíî-ìàòðè÷íîãî äåòåêòîðà. Ðàçäåëåíèå ïðîâîäèëè íà êîëîíêå Luna C18(2) ðàçìåðîì 2,0 × 100 ìì, ðàçìåð çåðíà ñîðáåíòà 1,9 ìêì ( Phenomenex, Ãåðìàíèÿ). Óïðàâëåíèå õðîìàòîãðàôîì è îáðàáîòêó äàííûõ ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììíîãî êîìïëåêñà Xcalibur.
Äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ ïîäâèæíîé ôàçû èñïîëüçîâàëè ðàñòâîðèòåëè êëàññà « gradient grade» ïðîèçâîäñòâà êîìïàíèè Panreac (Èñïàíèÿ).
Âçâåøèâàíèå ñòàíäàðòíûõ îáðàçöîâ ïðîâîäèëè íà âåñàõ Mettler Toledo H700, òî÷íîñòü êîòîðûõ ñîñòàâëÿëà 0,00001 ã.
Ðàçáàâëåíèå ðàñòâîðîâ ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ àâòîìàòè÷åñêèõ äîçàòîðîâ Eppendorf ñ ðàáî÷èì äèàïàçîíîì 100-1000 è 20-200 ìêë. Äîïóñòèìàÿ ïîãðåøíîñòü èçìåðåíèÿ ñîñòàâëÿëà íå áîëåå 5%.
- Ðåçóëüòàòû è èõ îáñóæäåíèå
Ïîäáîð è îïòèìèçàöèÿ óñëîâèé õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåíèÿ.
Ïîñêîëüêó êîýíçèì èìååò ïîëÿðíóþ ñòðóêòóðó, äëÿ ðàçäåëåíèÿ ñìåñè âûáðàëè âàðèàíò îáðàùåíî-ôàçîâîé õðîìàòîãðàôèè. Â äàííîì ðåæèìå íåïîäâèæíàÿ ôàçà ÿâëÿåòñÿ ìåíåå ïîëÿðíîé â ñðàâíåíèè ñ ïîäâèæíîé.
Âñëåäñòâèå ãèäðîôîáíîñòè êîýíçèìà Q10 ñëåäóåò îæèäàòü, ÷òî îí áóäåò óäåðæèâàòüñÿ íà íåïîëÿðíîé êîëîíêå â òå÷åíèå äëèòåëüíîãî âðåìåíè, ïîýòîìó â êà÷åñòâå ýëþåíòà íåîáõîäèì ðàñòâîðèòåëü èëè ñìåñü ðàñòâîðèòåëåé ñ âûñîêîé ýëþèðóþùåé ñïîñîáíîñòüþ.  ëèòåðàòóðå îïèñûâàþòñÿ ïîäâèæíûå ôàçû íà îñíîâå èçîïðîïèëîâîãî ñïèðòà [6], íî âÿçêîñòü òàêèõ ðàñòâîðîâ è, ñîîòâåòñòâåííî äàâëåíèå, êîòîðîå íóæíî ïðèëîæèòü, ÷òîáû ïðîêà÷àòü ýëþåíò ÷åðåç êîëîíêó, âåëèêî [7]. Ïîýòîìó ê èçîïðîïàíîëó äîáàâëÿëè ðàñòâîðèòåëü, îáëàäàþùåé ìåíüøåé âÿçêîñòüþ è õîðîøî ñìåøèâàþùèéñÿ ñ íèì – àöåòîíèòðèë.
Íà ïåðâîì ýòàïå ðàáîòû âûáðàëè îïòèìàëüíîå ñîîòíîøåíèå êîìïîíåíòîâ â ïîäâèæíîé ôàçå. Èçîïðîïèëîâûé ñïèðò è àöåòîíèòðèë ñìåøèâàëè â îïðåäåëåííûõ ïðîïîðöèÿõ, óðàâíîâåøèâàëè ñèñòåìó â òå÷åíèå 10 ìèíóò è ââîäèëè â ïðèáîð îáðàçåö ÁÀÄ «Êóäåñàí», ðàçáàâëåííûé â 10 ðàç ïîäâèæíîé ôàçîé. Äåòåêòèðîâàíèå îñóùåñòâëÿëè ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè äëèíå âîëíû 275 íì (ïîäáîð óñëîâèé äåòåêòèðîâàíèÿ ñì. äàëåå). Çàâèñèìîñòü âðåìåíè óäåðæèâàíèÿ êîýíçèìà Q10 îò êîíöåíòðàöèè èçîïðîïèëîâîãî cïèðòà â ïîäâèæíîé ôàçå ïîêàçàíà íà ðèñ. 4.
Ðèñ. 4 Çàâèñèìîñòü âðåìåíè óäåðæèâàíèÿ êîýíçèìà Q10 îò ñîäåðæàíèÿ èçîïðîïèëîâîãî ñïèðòà â ïîäâèæíîé ôàçå.
Íà ðèñ. 4 âèäíî, ÷òî ïðè ñîäåðæàíèè èçîïðîïèëîâîãî ñïèðòà â ñìåñè 90 % è áîëüøå, ïèê êîýíçèìà âûõîäèò âìåñòå ñ ìåðòâûì âðåìåíåì (âðåìÿ âûõîäà íåóäåðæèâàåìûõ êîìïîíåíòîâ). Ïðè êîíöåíòðàöèè èçîïðîïàíîëà â äèàïàçîíå îò 70 äî 90% ïèê êîýíçèìà ïåðåêðûâàåòñÿ ñ ïèêàìè ïðèìåñåé - äðóãèõ ñîñòàâëÿþùèõ «Êóäåñàí» [ïðèëîæåíèå 2]. Ïðè 60 % èçîïðîïèëîâîãî ñïèðòà âñå ïèêè õîðîøî ðàçðåøåíû, âìåñòå ñ òåì, àíàëèç çàíèìàåò î÷åíü ìàëî âðåìåíè (íå áîëåå 5 ìèíóò). Ïðè êîíöåíòðàöèè èçîïðîïàíîëà äî 60 %,ïèêè õîðîøî ðàçðåøåíû, íî àíàëèç çàíèìàåò íåîïðàâäàííî ìíîãî âðåìåíè. Ïîýòîìó äëÿ âñåõ äàëüíåéøèõ ýêñïåðèìåíòîâ èñïîëüçîâàëè ïîäâèæíóþ ôàçó ñîñòàâà èçîïðîïèëîâûé ñïèðò : àöåòîíèòðèë – 60:40. Ñêîðîñòü ïîòîêà ïîäâèæíîé ôàçû ñîñòàâèëà 400 ìêë/ìèí. Õðîìàòîãðàììà ìîäåëüíîãî ðàñòâîðà êîýíçèìà Q10 ïðåäñòàâëåíà íà ðèñ.5.
Ðèñ.5. Õðîìàòîãðàììà ìîäåëüíîãî ðàñòâîðà Q10. Êîíöåíòðàöèÿ êîýíçèìà 0.5 ìã/ìë.
Ñ ïîìîùüþ äèîäíî-ìàòðè÷íîãî äåòåêòîðà áûëè èçó÷åíû ñïåêòðû ïîãëîùåíèÿ ñòàíäàðòíîãî ðàñòâîðà êîýíçèìà Q10.
Ðèñ.6 Ñïåêòð ïîãëîùåíèÿ ðàñòâîðà Q10. Êîíöåíòðàöèÿ êîýíçèìà 0,5 ìã/ìë.
Ïðè ïîäáîðå êîëîíêè ó÷èòûâàëè ñòðîåíèå îïðåäåëÿåìîãî ñîåäèíåíèÿ, ÷òîáû ñîåäèíåíèå íà íåé çàäåðæèâàëîñü, ò.å. ñîðáèðîâàëîñü. Åñëè îíî íå áóäåò çàäåðæèâàòüñÿ, âçàèìîäåéñòâîâàòü ñ íåïîäâèæíîé ôàçîé âíóòðè êîëîíêè, òî ââîäèìàÿ ñìåñü âåùåñòâ, íå ðàçäåëèòüñÿ è íà õðîìàòîãðàììå íå áóäåò ðàçäåëåíèÿ ïèêîâ. Ìîëåêóëà êîýíçèìà ãèäðîôîáíàÿ, ïîýòîìó ïîäîáðàëè êîëîíêó, çàïîëíåííóþ ãèäðîôîáíûì ñîðáåíòîì. Ñàìûé ðàñïðîñòðàíåííûé, èçó÷åííûé è äîñòóïíûé âàðèàíò – ñèëèêàãåëü ñ ïðèâèòûì ê íåìó ãèäðîôîáíûì óãëåâîäîðîäíûì ðàäèêàëîì Ñ18 (ðèñ. 7).
Ðèñ.7. Ñòðóêòóðíàÿ ôîðìóëà ìîäèôèöèðîâàííîãî ñèëèêàãåëÿ
Ïåðåä àíàëèçîì îáðàçåö «Êóäåñàíà» ðàçâîäèëè â 100 ðàç ïîäâèæíîé ôàçîé äëÿ òîãî, ÷òîáû êîíöåíòðàöèÿ êîýíçèìà â ïðîáå áûëà íå òàêîé áîëüøîé. Äåòåêòîð ïðè êîíöåíòðàöèè 30 ìã/ë ïðîñòî çàøêàëèò, è ìû íå ñìîæåì ïðàâèëüíî ïîñ÷èòàòü êîíöåíòðàöèþ, îòêëèê íå áóäåò ïðîïîðöèîíàëåí êîëè÷åñòâó îïðåäåëÿåìîãî âåùåñòâà. Êðîìå ýòîãî íåðàçáàâëåííûé «Êóäåñàí» èìååò áîëüøóþ âÿçêîñòü, ÷òî ìåøàåò îñóùåñòâèòü âîñïðîèçâîäèìûé ââîä ïðîáû.
Äåòåêòèðîâàíèå ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêîãî äåòåêòîðà (îí èçìåðÿåò ïîãëîùåíèå æèäêîñòè, êîòîðàÿ ÷åðåç íåãî ïðîõîäèò) íà äëèíå âîëíû 275 íì.
Ðèñ. 8. Õðîìàòîãðàììà ïðåïàðàòà «Êóäåñàí» (óñëîâèÿ ñì. â òåêñòå).
Âèäíî, ÷òî â ïðåäëîæåííûõ íàìè óñëîâèÿõ äðóãèå êîìïîíåíòû «Êóäåñàí» íå ìåøàþò îïðåäåëåíèþ Q10 .
Äëÿ ïîñòðîåíèÿ ãðàäóèðîâî÷íîé çàâèñèìîñòè òî÷íóþ íàâåñêó ìîäåëüíîãî îáðàçöà ìàññîé îêîëî 25 ìã ïîìåùàëè â ìåðíóþ êîëáó, äîáàâëÿëè 15 ìë èçîïðîïèëîâîãî ñïèðòà è òùàòåëüíî ïåðåìåøèâàëè. Îáúåì äîâîäèëè äî ìåòêè àöåòîíèòðèëîì. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ñ êîíöåíòðàöèåé 1 ìã/ìë ïîñëåäîâàòåëüíî ðàçáàâëÿëè, ÷òîáû ïîëó÷èòü ñåðèþ ðàñòâîðîâ ñ ñîäåðæàíèåì êîýíçèìà 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 è 0,5 ìã/ìë ñîîòâåòñòâåííî. Êàæäûé ãðàäóèðîâî÷íûé ðàñòâîð àíàëèçèðîâàëè äâà ðàçà. Ïîëó÷åííàÿ çàâèñèìîñòü ïðèâåäåíà íà ðèñ. 9.
Ðèñ.9. Çàâèñèìîñòü ïëîùàäè õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ïèêà êîýíçèìà îò åãî êîíöåíòðàöèè
Çàòåì ïðîâîäèëè ðåãóëÿðíûå èçìåðåíèÿ â òå÷åíèå 40 äíåé. Âðåìÿ ïðèåìà ïðåïàðàòà ðàññ÷èòûâàëè èç ðåêîìåíäóåìîé ñóòî÷íîé äîçû (0,5 ìë â äåíü). Áûëè ñìîäåëèðîâàíû ñëåäóþùèå ñèòóàöèè: îòêðûòàÿ óïàêîâêà «Êóäåñàí» õðàíèòñÿ â õîëîäèëüíèêå (4°Ñ), äðóãàÿ îòêðûòàÿ óïàêîâêà õðàíèòñÿ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå (25 °Ñ), òðåòüÿ óïàêîâêà õðàíèòñÿ îêîëî áàòàðåè (40°Ñ). Ðåãóëÿðíî ïðîâîäèëè àíàëèç ñîäåðæèìîãî êàæäîé óïàêîâêè. Äëÿ òî÷íîñòè ðåçóëüòàòà èç êàæäîé ñìåñè ãîòîâèëè ïî òðè ïðîáû, à äëÿ ïîñòðîåíèÿ çàâèñèìîñòè ñ÷èòàëè ñðåäíåå çíà÷åíèå. Ðåçóëüòàòû èçìåðåíèé îòðàæåíû íà ðèñóíêå 10.
Ðèñ. 10. Èçìåíåíèå êîíöåíòðàöèè êîýíçèìà Q10 â ÁÀÄ «Êóäåñàí» â òå÷åíèå 40 äíåé
Íà ðèñ. 9 âèäíî, ÷òî â «Êóäåñàíå», õðàíÿùåìñÿ ïðè òåìïåðàòóðå 4 °Ñ è 25 °Ñ, ñîäåðæàíèå êîýíçèìà Q10 ïðàêòè÷åñêè íå ìåíÿåòñÿ (îòêëîíåíèÿ íàõîäÿòñÿ â ïðåäåëàõ ïîãðåøíîñòè), òîãäà êàê ïðè òåìïåðàòóðå 40 °Ñ ñîäåðæàíèå êîýíçèìà Q10 óìåíüøèëîñü íà 15 %. Çíà÷èò, ïðè òåìïåðàòóðå âûøå êîìíàòíîé õðàíèòü ÁÀÄ «Êóäåñàí» íå ñëåäóåò.
5. Çàêëþ÷åíèå
- Ïîäîáðàíû è îïòèìèçèðîâàíû óñëîâèÿ õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî îïðåäåëåíèÿ êîýíçèìà
Q10 â ÁÀÄ «Êóäåñàí»: ðàçäåëåíèå ñìåñè íà êîëîíêå Luna Ñ18 ñ èñïîëüçîâàíèåì ïîäâèæíîé ôàçû èçîïðîïàíîë C3H7OH: àöåòîíèòðèë CH3CN â ñîîòíîøåíèè 60:40.
Ïîñòðîåíà ãðàäóèðîâî÷íàÿ çàâèñèìîñòü äëÿ Q10: ïëîùàäü õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ïèêà ïðÿìî ïðîïîðöèîíàëüíà êîíöåíòðàöèè êîýíçèìà Q10 â äèàïàçîíå 0,01 – 1 ìã/ìë.
Èçó÷åíà ñòàáèëüíîñòü êîýíçèìà Q10 â ÁÀÄ «Êóäåñàí» ïðè ðàçëè÷íûõ óñëîâèÿõ õðàíåíèÿ: ïðè òåìïåðàòóðå 4 °Ñ è 20 °Ñ êîíöåíòðàöèÿ êîýíçèìà Q10 â òå÷åíèå 40 äíåé ïðàêòè÷åñêè íå èçìåíèëàñü, à ïðè òåìïåðàòóðå 40 °Ñ êîíöåíòðàöèÿ êîýíçèìà óìåíüøèëàñü íà 15%.
- Ñïèñîê èñïîëüçîâàííîé ëèòåðàòóðû
[1] Ïàøêîâà Å.Á., Ïèðîãîâ À.Â., Áåíäðûøåâ À.À., Øïèãóí Î.À. Îïðåäåëåíèå êîýíçèìà Q10 è ðîäñòâåííûõ ñîåäèíåíèé â áèîëîãè÷åñêèõ îáúåêòàõ ìåòîäîì ÂÝÆÕ-ÌÑ // Òåç. äîêëàäîâ Âñåðîññèéñêîãî ñèìïîçèóìà «Õðîìàòîãðàôèÿ â õèìè÷åñêîì àíàëèçå è ôèçèêî-õèìè÷åñêèõ èññëåäîâàíèÿõ». Ìîñêâà, 2007
[2] Êîôåðìåíòû. Ïîä ðåä. ïðîô. Â.À. ßêîâëåâà. Ì.: Ìåäèöèíà, 1973. 377 ñ.
[ 3] Õèìè÷åñêàÿ ýíöèêëîïåäèÿ. Ãë. ðåä. Í.Ñ.Çåôèðîâ. Ì.: Ñîâåòñêàÿ ýíöèêëîïåäèÿ, 1999. Ò. 5. Ñòð. 21-22.
[4] Ñòûñêèí Å.Ë., Èöèêñîí Ë.Á., Áðàóäå Å.Â. Ïðàêòè÷åñêàÿ Âûñîêîýôôåêòèâíàÿ Æèäêîñòíàÿ Õðîìàòîãðàôèÿ. Ì. 1986. 284 ñ.
[5] Ìåäâåäåâ Î.Ñ., Ãîðîäåöêàÿ Å.À, Êàëåíèêîâà Å.È.. Ôàðìàêîêèíåòèêà êîýíçèìà Q10. Áþëëåòåíü ýêñïåðèìàåíòàëüíîé áèîëîãèè è ìåäèöèíû. 2008. ¹ 9, ñòð. 281-287.
[6] Ïàòåíò RU 2377019. 01.02.2006 ã. Òðàíñïîðòèðóþùèé íàïîëíèòåëü äëÿ ýíòåðàëüíîãî ïðèìåíåíèÿ.
[7] Õèìè÷åñêèé ýíöèêëîïåäè÷åñêèé ñëîâàðü. Ãë. ðåä. È.Ë. Êíóíÿíö.- Ì.: Ñîâåòñêàÿ ýíöèêëîïåäèÿ, 1983. 792 ñ.
7. Ïðèëîæåíèå
Ïðèëîæåíèå 1
Ñîäåðæàíèå êîýíçèìà Q10 â áèîëîãè÷åñêèõ îáúåêòàõ
|
Îáúåêò |
Êîíöåíòðàöèÿ, ìêã/ã |
|
Øïèíàò |
203 |
|
Êðûñà (ïî÷êè) |
22,0 |
|
Êðûñà (ïå÷åíü) |
21,3 |
|
Êðûñà (ìîçã) |
18,9 |
|
Êóðèöà (ìîçã) |
17,1 |
|
Êðûñà (ñåðäöå) |
16,9 |
|
Ãîâÿæèé ôàðø |
16 |
|
Áàëòèéñêàÿ ñåëüäü |
13 |
|
Êðûñà (ñåëåçåíêà) |
9,2 |
|
Êðûñà (êàìáàëîâèäíàÿ ìûøöà) |
6 |
|
Ìûøü (ìîçã) |
5,2 |
|
Ìûøü (ñåðäöå) |
5 |
|
Ìûøå÷íàÿ òêàíü ëÿãóøêè |
4,9 |
|
Êðûñà (ëåãêèå) |
2,4 |
|
Àïåëüñèíû |
2 |
|
×åëîâåê (ïëàçìà êðîâè) |
0,8 |
Ïðèëîæåíèå 2
Õðîìàòîãðàììà ïðåïàðàòà «Êóäåñàí». Ðàçáàâëåíèå â 100 ðàç ïîäâèæíîé ôàçîé. Ïîäâèæíàÿ ôàçà – 80% èçîïðîïàíîëà, 20% àöåòîíèòðèëà.
Ðóáðèêè (ðàçäåëû) ñàéòà, ñîäåðæàùèå
ïóáëèêàöèè ïî ïðîáëåìàì îðãàíèçàöèè
èññëåäîâàòåëüñêîé è ïðîåêòíîé äåÿòåëüíîñòè
øêîëüíèêîâ:
Íà íàøåì ñàéòå, ïîìèìî òåêóùåãî ðàçäåëà, åñòü òàêæå òðè äðóãèõ ðàçäåëà, òàêæå ïîñâÿùåííûå
èññëåäîâàòåëüñêîé è ïðîåêòíîé äåÿòåëüíîñòè øêîëüíèêîâ. Ýòî ðàçäåë Âåáèíàðû,
ïîñâÿùåííûé âîïðîñàì îðãàíèçàöèè èññëåäîâàòåëüñêîé äåÿòåëüíîñòè øêîëüíèêîâ â ïðèðîäå, à òàêæå ðàçäåëû
Èññëåäîâàòåëüñêèå ðàáîòû è Ïóáëèêàöèè.
Ïîñëåäíèå äâà ðàçäåëà îòëè÷àþòñÿ îò òåêóùåãî ðàçäåëà òåì, ÷òî òàì ñîáðàíû äåòñêèå èññëåäîâàòåëüñêèå ðàáîòû è
ïóáëèêàöèè ïåäàãîãîâ ïî òåìàòèêå "ïîëåâîãî èçó÷åíèå ïðèðîäû", ò.å. èñêëþ÷èòåëüíî ðàáîòû, âûïîëíåííûå èëè îïèñûâàþùèå
èññëåäîâàòåëüñêóþ äåÿòåëüíîñòü øêîëüíèêîâ Â ÏÐÈÐÎÄÅ. Äàííûé æå ðàçäåë ïîñâÿùåí áîëåå îáùèì âîïðîñàì îðãàíèçàöèè èññëåäîâàòåëüñêîé è
ïðîåêòíîé äåÿòåëüíîñòè.
Âíèìàíèå! Íà íàøåì ñàéòå ìû ãîòîâû ïóáëèêîâàòü
ñòàòüè ïî âîïðîñàì îðãàíèçàöèè ýêîëîãè÷åñêîãî
îáðàçîâàíèÿ äåòåé â ïðèðîäå, êîòîðûå ìîãóò áûòü ïîëåçíû
êîëëåãàì ïî âñåé ñòðàíå. Ýòî ìîãóò áûòü
ïðîáëåìíûå ñòàòüè, àâòîðñêèå îáðàçîâàòåëüíûå
ïðîãðàììû, ìåòîäè÷åñêèå ïîñîáèÿ,
íîðìàòèâíî-èíñòðóêòèâíûå äîêóìåíòû è ìàòåðèàëû,
ôîòîãðàôèè, îò÷åòû è ò.ï. ïî òàêèì òåìàòèêàì
êàê:
- ïîëåâûå ïðàêòèêóìû,
- ýêîëîãè÷åñêèå îáðàçîâàòåëüíûå ýêñïåäèöèè,
- ýêîëîãè÷åñêèå ëàãåðÿ,
- êîíêóðñû äåòñêèõ èññëåäîâàòåëüñêèõ ðàáîò (ïðîåêòîâ),
- ìàòåðèàëû ñåìèíàðîâ è êîíôåðåíöèé,
- ìåòîäèêè ïîëåâûõ èññëåäîâàíèé (ïðîåêòíîé äåÿòåëüíîñòè),
- äåòñêèå èññëåäîâàòåëüñêèå ðàáîòû (ïðîåêòû),
- ýêîëîãè÷åñêèå òðîïû,
- "ýêñïåäèöèîííàÿ æèçíü".
Î Âàñ è Âàøåì îïûòå óçíàåò âñÿ Ðîññèÿ, à
ãëàâíîå - Âû ñìîæåòå ïðèíåñòè ïîëüçó ñèñòåìå
ýêîëîãè÷åñêîãî îáðàçîâàíèÿ íàøåé ñòðàíû,
"âëîæèòü ñâîþ ëåïòó" â ñîâåðøåíñòâîâàíèå
ôîðì è ìåòîäîâ ðàáîòû ñ äåòüìè!
Åñëè Âû ãîòîâû ïîäåëèòüñÿ ñâîèì îïûòîì ñ
êîëëåãàìè ïî âñåé ñòðàíå - ïðèñûëàéòå
ñâîè ïðåäëîæåíèÿ (êðàòêî îïèøèòå ñâîè ìàòåðèàëû),
ìû ðàññìîòðèì èõ è âìåñòå îáñóäèì íàèáîëåå
îïòèìàëüíóþ ôîðìó èõ ïóáëèêàöèè íà íàøåì ñàéòå.
Ïðàêòèêóìû
Ñåìèíàðû
Âåáèíàðû
Èññëåäîâàòåëüñêàÿ ðàáîòà
Ýêñïåäèöèè è ëàãåðÿ
Ýêîòðîïû
Ýêîëîãè÷åñêèå èãðû
Ïóáëèêàöèè
|
