|
Практикумы
Семинары
Вебинары
Исследовательская работа
Экспедиции и лагеря
Экотропы
Экологические игры
Публикации
 
Приведенная ниже работа была
опубликована в журнале "Исследовательская
работа школьников" Издательского дома
"Народное образование" и была любезно
предоставлена главным редактором журнала О.В.Глушенковым
в 2017 году.
Из огромного количества статей, опубликованных
в журнале за годы его работы в 2011-2016 гг, мы
отобрали публикации в области экологии, биологии,
географии и краеведения, а также небольшое число
работ по археологии, истории и культуре.
Для облегчения поиска и навигации по
данному разделу, все работы сгруппированы по
нескольким нижеследующим рубрикам:
Общие вопросы - теория,
Общие вопросы - практика,
География,
Биология,
Экология - теория,
Экология - практика,
Детские исследовательские работы и проекты по географии, биологии и экологии
Примечания: 1) приведенная ниже работа размещена на нашем сайте в оригинальном виде, т.е. так, как она была предоставлена для публикации в журнале; 2) автор сайта не несет ответственности за достоверность сведений, изложенных в работе; 3) данная работа является авторской и ее перепечатка возможна только с указанием авторов и активной гиперссылкой на наш сайт.
Исследование стабильности коэнзима Q10 в БАД «Кудесан»
в зависимости от условия хранения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Ольга Тихонова
МБОУ СОШ № 11, г. Обнинск, Калужская область
Руководитель: к.х.н. Пашкова Е.Б.,
ООО «БИОН»
1. Введение
Убихиноны (коферменты Q) были обнаружены в 1967 году, и уже через несколько лет получили широкое применение в качестве антиоксидантов. В последнее десятилетие была установлена связь между содержанием убихинона и нарушениями в деятельности сердечно-сосудистой системы. К настоящему моменту разработано большое количество биологически активных добавок, косметических и лекарственных препаратов, содержащих в своем составе кофермент Q10, характерный для организма человека.
Убихиноны постоянно синтезируются в организме из тирозина либо фенилаланина [1]. Больше всего их в органах с активным метаболизмом – сердце, печени, селезенке и мозге. Суммарный уровень коэнзима Q10 достигает своего максимума к 20 годам и затем постепенно снижается с возрастом [1]. Поэтому необходимо поступление коэнзима Q10 в организм человека с пищей либо при помощи биологически активных добавок (БАДов). Содержание коэнзима Q10 в продуктах питания относительно невелико. Например, в шпинате (продукт, наиболее богатый коэнзимом) его содержание составляет всего лишь 200 мкг/г. В мясных и рыбных продуктах (говядина, свинина, морская рыба) количество Q10 находится на уровне 10-20 мкг/г [приложение 1]. Поэтому наиболее удобным источником коэнзима являются разнообразные биологические добавки.
Одной из таких БАД, содержащих коэнзим Q10 является «Кудесан». В нем содержится 30 мг/мл коэнзима Q10 (как заявлено производителем). Но при этом в сопроводительной документации не указаны условия хранения БАД «Кудесан». Достоверно не известно, меняется ли концентрация коэнзима в образце с течением времени приема препарата (35–40 дней). Соответственно, целью моей работы являлось исследование стабильности коэнзима Q10 в БАД на протяжении этого времени, а также выбор оптимальных условий хранения вскрытой упаковки.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
- Изучить существующие методы определения коэнзима Q10 в различных объектах;
- Разработать методику определения Q10 в БАД «Кудесан»;
- Исследовать стабильность коэнзима при различных условиях хранения.
- Литературный обзор
Убихиноны представляют собой 2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохиноны с полипренильной цепочкой различной длины в шестом положении (рис. 1). На основании рекомендации IUPAC убихиноны обозначают как Qn, где n – число изопреновых звеньев в боковой цепи. Все изопреновые звенья в молекуле находятся в транс-положении. Такая структура придает убихинону высокое сродство к клеточным мембранам [2].
Рис. 1. Структурная формула убихинона.
Одной из функций коэнзимов Q в организме является перенос электронов при синтезе АТФ на мембранах митохондрий [3]. Не менее важной является его роль как жирорастворимого антиоксиданта. Восстановленная форма – убихинол – обладает способностью захватывать пероксидные радикалы (LOO∙), защищая таким образом клетки.
QnH 2 + 2LOO· = Qn + 2LOOH
Рис. 2. Структурная формула убихинола.
Соотношение окисленной и восстановленной формы постоянно вне зависимости от того, в какой форме коэнзим поступает в организм человека. Нарушение этого соотношения может свидетельствовать о заболеваниях обмена веществ, а также проблемах с сердечно-сосудистой системой [1].
Все убихиноны нерастворимы в воде, зато растворяются в большинстве органических растворителей. Соответственно, БАД, в состав которых входят коэнзимы, должны в своей основе содержать значительное количество либо спирта, либо растительных масел. «Кудесан» является достаточно сложной многокомпонентной системой. В его состав, помимо коэнзима, входят добавки жирорастворимых витаминов, растительные масла, эмульгаторы и консерванты. Таким образом, выбранный для анализа метод определения Q10 должен быть достаточно селективным.
Исходя из литературных данных, для определения коэнзимов Q применяют три основные группы методов: электрохимические, спектрофотометрические и хроматографические [2]. Однако электрохимический метод требует сложной пробоподготовки, а спектрофотометрический метод хоть и является дешевым и быстрым, но не обладает достаточной селективностью. Поэтому выбрали метод высокоэффективной жидкостной (жидкостнотвердофазной) хроматографии.
Хроматография – физико-химический метод разделения веществ в динамических условиях. Компоненты разделяемой смеси распределяются между двумя фазами, неподвижной и подвижной (элюент). Неподвижная фаза представляет собой сорбент с развитой поверхностью, а подвижная – поток газа (пара, флюида – вещества в сверхкритическом состоянии) или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента [4].
Рис. 3. Схема жидкостного хроматографа
Подвижная фаза (элюент) прокачивается насосом через хроматографическую колонку, где, собственно, и происходит разделение компонентов пробы. Далее вещества вместе с током подвижной фазы попадают в детектор, который дает отклик (аналитический сигнал) на их присутствие в элюате. Подвижная фаза может состоять из одного или нескольких растворителей, причем их концентрация в ходе анализа может оставаться, как постоянной (изократический вариант), так и меняться по заданной программе (градиентный режим). Ввод пробы осуществляется либо вручную, либо при помощи специального устройства для автоматического ввода – автосэмплера. Управление всеми модулями прибора, сбор и обработка данных осуществляются с помощью компьютера и набора соответствующих программ. Все детекторы можно разделить на селективные (которые чувствительны только к определенным классам химических соединений) и универсальные (дающие отклик на широкий круг веществ). В литературе описано большое количество различных вариантов детектирования, применяемых при хроматографическом определении коэнзима Q10.
В последнее время широкое распространение получило масс-спектрометрическое детектирование. Его принцип основан на том, что все соединения, содержащиеся в элюате, ионизируются, и прибор регистрирует ион с определенным значением масса/заряд (m/z). Это значение является уникальным для каждого соединения, что обуславливает очень высокую селективность и чувствительность определения. Метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием активно используется при клинических исследованиях, при работе со сложными биологическими образцами (плазма крови, ткани органов) [4]. Из минусов такого оборудования в первую очередь нужно отметить высокую цену и трудности в эксплуатации.
Наличие хинольной группировки в составе коэнзимов Q10 делает возможным использование электрохимического детектирования. В этом случае регистрируется переход от восстановленной формы коэнзима к окисленной. Но такой вариант детектирования требует достаточно сложного оборудования, например, детектор с двойной ячейкой [5].
Наиболее простой, доступный и распространенный вариант – спектрофотометрическое детектирование. Единственный недостаток этого метода заключается в низкой селективности детектирования, поэтому необходимо предварительное полное разделение всех компонентов анализируемой смеси.
Таким образом, для нашей работы мы выбрали самый доступный и распространенный спектрофотометрический детектор.
3. Экспериментальная часть
Анализ проводили на жидкостном хроматографе Acella 600 (Thermo, США). Хроматограф состоял из градиентного насоса, он-лайн дегазатора подвижной фазы, автосэмплера, термостата колонок и диодно-матричного детектора. Разделение проводили на колонке Luna C18(2) размером 2,0 × 100 мм, размер зерна сорбента 1,9 мкм ( Phenomenex, Германия). Управление хроматографом и обработку данных проводили с помощью программного комплекса Xcalibur.
Для приготовления подвижной фазы использовали растворители класса « gradient grade» производства компании Panreac (Испания).
Взвешивание стандартных образцов проводили на весах Mettler Toledo H700, точность которых составляла 0,00001 г.
Разбавление растворов проводили с помощью автоматических дозаторов Eppendorf с рабочим диапазоном 100-1000 и 20-200 мкл. Допустимая погрешность измерения составляла не более 5%.
- Результаты и их обсуждение
Подбор и оптимизация условий хроматографического разделения.
Поскольку коэнзим имеет полярную структуру, для разделения смеси выбрали вариант обращено-фазовой хроматографии. В данном режиме неподвижная фаза является менее полярной в сравнении с подвижной.
Вследствие гидрофобности коэнзима Q10 следует ожидать, что он будет удерживаться на неполярной колонке в течение длительного времени, поэтому в качестве элюента необходим растворитель или смесь растворителей с высокой элюирующей способностью. В литературе описываются подвижные фазы на основе изопропилового спирта [6], но вязкость таких растворов и, соответственно давление, которое нужно приложить, чтобы прокачать элюент через колонку, велико [7]. Поэтому к изопропанолу добавляли растворитель, обладающей меньшей вязкостью и хорошо смешивающийся с ним – ацетонитрил.
На первом этапе работы выбрали оптимальное соотношение компонентов в подвижной фазе. Изопропиловый спирт и ацетонитрил смешивали в определенных пропорциях, уравновешивали систему в течение 10 минут и вводили в прибор образец БАД «Кудесан», разбавленный в 10 раз подвижной фазой. Детектирование осуществляли спектрофотометрически при длине волны 275 нм (подбор условий детектирования см. далее). Зависимость времени удерживания коэнзима Q10 от концентрации изопропилового cпирта в подвижной фазе показана на рис. 4.
Рис. 4 Зависимость времени удерживания коэнзима Q10 от содержания изопропилового спирта в подвижной фазе.
На рис. 4 видно, что при содержании изопропилового спирта в смеси 90 % и больше, пик коэнзима выходит вместе с мертвым временем (время выхода неудерживаемых компонентов). При концентрации изопропанола в диапазоне от 70 до 90% пик коэнзима перекрывается с пиками примесей - других составляющих «Кудесан» [приложение 2]. При 60 % изопропилового спирта все пики хорошо разрешены, вместе с тем, анализ занимает очень мало времени (не более 5 минут). При концентрации изопропанола до 60 %,пики хорошо разрешены, но анализ занимает неоправданно много времени. Поэтому для всех дальнейших экспериментов использовали подвижную фазу состава изопропиловый спирт : ацетонитрил – 60:40. Скорость потока подвижной фазы составила 400 мкл/мин. Хроматограмма модельного раствора коэнзима Q10 представлена на рис.5.
Рис.5. Хроматограмма модельного раствора Q10. Концентрация коэнзима 0.5 мг/мл.
С помощью диодно-матричного детектора были изучены спектры поглощения стандартного раствора коэнзима Q10.
Рис.6 Спектр поглощения раствора Q10. Концентрация коэнзима 0,5 мг/мл.
При подборе колонки учитывали строение определяемого соединения, чтобы соединение на ней задерживалось, т.е. сорбировалось. Если оно не будет задерживаться, взаимодействовать с неподвижной фазой внутри колонки, то вводимая смесь веществ, не разделиться и на хроматограмме не будет разделения пиков. Молекула коэнзима гидрофобная, поэтому подобрали колонку, заполненную гидрофобным сорбентом. Самый распространенный, изученный и доступный вариант – силикагель с привитым к нему гидрофобным углеводородным радикалом С18 (рис. 7).
Рис.7. Структурная формула модифицированного силикагеля
Перед анализом образец «Кудесана» разводили в 100 раз подвижной фазой для того, чтобы концентрация коэнзима в пробе была не такой большой. Детектор при концентрации 30 мг/л просто зашкалит, и мы не сможем правильно посчитать концентрацию, отклик не будет пропорционален количеству определяемого вещества. Кроме этого неразбавленный «Кудесан» имеет большую вязкость, что мешает осуществить воспроизводимый ввод пробы.
Детектирование проводили с использованием спектрофотометрического детектора (он измеряет поглощение жидкости, которая через него проходит) на длине волны 275 нм.
Рис. 8. Хроматограмма препарата «Кудесан» (условия см. в тексте).
Видно, что в предложенных нами условиях другие компоненты «Кудесан» не мешают определению Q10 .
Для построения градуировочной зависимости точную навеску модельного образца массой около 25 мг помещали в мерную колбу, добавляли 15 мл изопропилового спирта и тщательно перемешивали. Объем доводили до метки ацетонитрилом. Полученный раствор с концентрацией 1 мг/мл последовательно разбавляли, чтобы получить серию растворов с содержанием коэнзима 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 и 0,5 мг/мл соответственно. Каждый градуировочный раствор анализировали два раза. Полученная зависимость приведена на рис. 9.
Рис.9. Зависимость площади хроматографического пика коэнзима от его концентрации
Затем проводили регулярные измерения в течение 40 дней. Время приема препарата рассчитывали из рекомендуемой суточной дозы (0,5 мл в день). Были смоделированы следующие ситуации: открытая упаковка «Кудесан» хранится в холодильнике (4°С), другая открытая упаковка хранится при комнатной температуре (25 °С), третья упаковка хранится около батареи (40°С). Регулярно проводили анализ содержимого каждой упаковки. Для точности результата из каждой смеси готовили по три пробы, а для построения зависимости считали среднее значение. Результаты измерений отражены на рисунке 10.
Рис. 10. Изменение концентрации коэнзима Q10 в БАД «Кудесан» в течение 40 дней
На рис. 9 видно, что в «Кудесане», хранящемся при температуре 4 °С и 25 °С, содержание коэнзима Q10 практически не меняется (отклонения находятся в пределах погрешности), тогда как при температуре 40 °С содержание коэнзима Q10 уменьшилось на 15 %. Значит, при температуре выше комнатной хранить БАД «Кудесан» не следует.
5. Заключение
- Подобраны и оптимизированы условия хроматографического определения коэнзима
Q10 в БАД «Кудесан»: разделение смеси на колонке Luna С18 с использованием подвижной фазы изопропанол C3H7OH: ацетонитрил CH3CN в соотношении 60:40.
Построена градуировочная зависимость для Q10: площадь хроматографического пика прямо пропорциональна концентрации коэнзима Q10 в диапазоне 0,01 – 1 мг/мл.
Изучена стабильность коэнзима Q10 в БАД «Кудесан» при различных условиях хранения: при температуре 4 °С и 20 °С концентрация коэнзима Q10 в течение 40 дней практически не изменилась, а при температуре 40 °С концентрация коэнзима уменьшилась на 15%.
- Список использованной литературы
[1] Пашкова Е.Б., Пирогов А.В., Бендрышев А.А., Шпигун О.А. Определение коэнзима Q10 и родственных соединений в биологических объектах методом ВЭЖХ-МС // Тез. докладов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». Москва, 2007
[2] Коферменты. Под ред. проф. В.А. Яковлева. М.: Медицина, 1973. 377 с.
[ 3] Химическая энциклопедия. Гл. ред. Н.С.Зефиров. М.: Советская энциклопедия, 1999. Т. 5. Стр. 21-22.
[4] Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая Высокоэффективная Жидкостная Хроматография. М. 1986. 284 с.
[5] Медведев О.С., Городецкая Е.А, Каленикова Е.И.. Фармакокинетика коэнзима Q10. Бюллетень эксперимаентальной биологии и медицины. 2008. № 9, стр. 281-287.
[6] Патент RU 2377019. 01.02.2006 г. Транспортирующий наполнитель для энтерального применения.
[7] Химический энциклопедический словарь. Гл. ред. И.Л. Кнунянц.- М.: Советская энциклопедия, 1983. 792 с.
7. Приложение
Приложение 1
Содержание коэнзима Q10 в биологических объектах
|
Объект |
Концентрация, мкг/г |
|
Шпинат |
203 |
|
Крыса (почки) |
22,0 |
|
Крыса (печень) |
21,3 |
|
Крыса (мозг) |
18,9 |
|
Курица (мозг) |
17,1 |
|
Крыса (сердце) |
16,9 |
|
Говяжий фарш |
16 |
|
Балтийская сельдь |
13 |
|
Крыса (селезенка) |
9,2 |
|
Крыса (камбаловидная мышца) |
6 |
|
Мышь (мозг) |
5,2 |
|
Мышь (сердце) |
5 |
|
Мышечная ткань лягушки |
4,9 |
|
Крыса (легкие) |
2,4 |
|
Апельсины |
2 |
|
Человек (плазма крови) |
0,8 |
Приложение 2
Хроматограмма препарата «Кудесан». Разбавление в 100 раз подвижной фазой. Подвижная фаза – 80% изопропанола, 20% ацетонитрила.
Рубрики (разделы) сайта, содержащие
публикации по проблемам организации
исследовательской и проектной деятельности
школьников:
На нашем сайте, помимо текущего раздела,
есть также два других раздела, тоже посвященные
исследовательской и проектной деятельности
школьников. Это разделы Исследовательские
работы и Публикации. Их
отличие от текущего раздела в том, что там
собраны детские исследовательские работы и
публикации педагогов по тематике "полевого
изучение природы", т.е. исключительно
работы, выполненные или описывающие
исследовательскую деятельность школьников В
ПРИРОДЕ. Данный же раздел посвящен более
общим вопросам организации исследовательской и
проектной деятельности.
Внимание! На нашем сайте мы готовы публиковать
статьи по вопросам организации экологического
образования детей в природе, которые могут быть полезны
коллегам по всей стране. Это могут быть
проблемные статьи, авторские образовательные
программы, методические пособия,
нормативно-инструктивные документы и материалы,
фотографии, отчеты и т.п. по таким тематикам
как:
- полевые практикумы,
- экологические образовательные экспедиции,
- экологические лагеря,
- конкурсы детских исследовательских работ (проектов),
- материалы семинаров и конференций,
- методики полевых исследований (проектной деятельности),
- детские исследовательские работы (проекты),
- экологические тропы,
- "экспедиционная жизнь".
О Вас и Вашем опыте узнает вся Россия, а
главное - Вы сможете принести пользу системе
экологического образования нашей страны,
"вложить свою лепту" в совершенствование
форм и методов работы с детьми!
Если Вы готовы поделиться своим опытом с
коллегами по всей стране - присылайте
свои предложения (кратко опишите свои материалы),
мы рассмотрим их и вместе обсудим наиболее
оптимальную форму их публикации на нашем сайте.
Практикумы
Семинары
Вебинары
Исследовательская работа
Экспедиции и лагеря
Экотропы
Экологические игры
Публикации
|
